代谢性酸中毒
代谢性酸中毒 篇1
1材料与方法
1.1 材料
雄性昆明小鼠20只, 由吉林大学实验动物中心提供, 体重18±2 g, 合格证号:SCXK (吉) 2007-0003。Na+-K+-ATP酶、Mg2+-ATP酶和Ca2+-ATP酶试剂盒、考马斯亮蓝试剂盒、超氧化物歧化酶 (SOD) 、丙二醛 (MDA) 、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。氧化乐果, 生产批号0710112, 购自上海化工有限公司, 纯度为95% 。
1.2 方法
将20只雄性小鼠随机分成2组, 每组10只。实验前禁食8 h。氧化乐果用生理盐水配成溶液, 按25 mg/kg体重腹腔注射染毒组小鼠;对照组给予等量生理盐水注射。染毒组均出现中毒症状:肢体震颤, 流涎, 竖毛, 呼吸急促等。30 min后断髓处死, 迅速取出心脏放入冰冷的生理盐水中漂洗, 除去血液, 用滤纸拭干, 称重。加生理盐水适量, 在冰水浴中制成10%匀浆。1 000 r/min低温离心5 min, 取上清液, 稀释至2%匀浆, 备用。所测各项指标按照试剂盒说明操作。用考马斯亮蓝比色法测定组织蛋白含量。
1.3 统计学分析
结果数据以undefined表示, 用SPSS11.0软件进行t检验。
2结果
小鼠在氧化乐果中毒30 min 后, 心肌组织中的Na+-K+-ATP酶、Mg2+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性均明显降低 (P<0.05) , 如表1 所示。
染毒组小鼠心肌组织SOD、GSH-Px含量明显低于对照组 (P<0.05) , 而MDA含量高于对照组 (P<0.05) , 如表2所示。
3讨论
近来, 细胞能量代谢障碍和内环境紊乱被认为是有机磷中毒非胆碱效应机制之一, 逐渐引起了人们的关注。国内曾晓苹[1]研究后认为, 对能量转换的抑制可能是有机磷杀虫剂作用机制的一个关键组分, 其在有机磷中毒的许多合并症, 如心肌损害、中间综合征和中枢神经系统抑制等的发生发展中起重要作用。有文献报道, 氟磷酸二异丙醋、对氧磷和对硫磷能引起心肌纤维和线粒体ATP酶活性抑制;敌敌畏能引起脑组织ATP酶活性降低;氧化乐果可降低骨骼肌组织的ATP酶活性[2,3]。本实验亦得出类似结论:氧化乐果中毒30 min后, 小鼠心肌组织Na+-K+-ATP酶、Mg2+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性均明显降低 (P<0.05) 。
心肌细胞ATP酶活性受抑制, 将引起严重后果。Na+-K+-ATP酶抑制后, 细胞外钠内流增加, 心肌细胞肿胀、钠水储留, 使线粒体功能受损, 高能磷酸化合物生成减少, 能量代谢障碍, 最终将影响心肌细胞收缩功能。细胞内钾外流增加, 造成细胞内缺钾, 细胞外高钾, 使心肌生物电不稳定, 容易诱发心律失常, 特别是尖端扭转性室速。另外, Mg2+-ATP 酶抑制后, 细胞内镁外流增加, 使细胞内缺镁, 细胞内外镁分布紊乱, 容易诱发室性心律失常, 特别是尖端扭转性室速。临床上己有有机磷中毒致尖端扭转性室速的报道[4]。
Na+-K+-ATP 酶是另一个调节细胞钙水平的ATP 酶, 其作用除了维持钾稳态水平、产生和维持动作电位、调节细胞容积外, 还可通过Na+-Ca2+交换调节细胞内的钙浓度。细胞内缺镁还能促进钙内流, 并加重细胞内钙超载所致损伤[5]。乙酰胆碱在突触前膜的释放也是通过Ca2+的浓度变化进行控制的, 由于组织ATP 酶的活性水平降低, 细胞内Ca2+的浓度增加, 可以导致乙酰胆碱释放增加。
ATP酶之间的生物活性是互相影响的, 而且对农药的胆碱效应和其他效应有一定影响。Ca2+-ATP酶抑制后, 细胞外钙内流增加, 引起细胞内钙超载, 自由基产生增多, 并进一步损害线粒体膜的功能, 也将影响细胞能量代谢。Mg2+是体内许多酶的激活剂, Mg2+-ATP 酶抑制后, 细胞内镁外流增加, 使细胞内缺镁, 进而造成细胞内多种酶抑制, 并引起自由基产生增多, 引发生物膜过氧化损伤[6]。SOD广泛存在于需氧代谢细胞中, 能够清除氧自由基, 保护细胞免受损害, 其活性变化与机体氧化损伤程度密切相关[7]。MDA是其代谢终产物之一, 其含量的变化可以反映组织中氧自由基含量及机体内环境的氧化应激程度[8]。本研究实验结果显示, 急性有机磷中毒可致小鼠SOD和GSH-Px降低, MDA升高, 表明急性有机磷中毒可引起心肌损害, 其机制可能与自由基引起心肌细胞脂质过氧化有关。
参考文献
[1]曾晓苹.杀虫剂对家蝇线粒体ATP酶活性影响的研究〔J〕.中国媒介生物学及控制杂志, 1995, 6 (4) :253-256.
[2]宁宗, 邝晓聪, 李其斌, 等.敌敌畏急性中毒小鼠脑ATP酶的活性检测〔J〕.苏州大学学报 (医学版) , 2006, 26 (3) :604-607.
[3]李长喻, 赵敏, 杨柳, 等.急性有机磷农药中毒大鼠骨骼肌组织ATP酶活性的变化及硫酸镁对其影响〔J〕.中华急诊医学杂志, 2005, 14 (4) :672-675.
[4]Kiss I, Fazekas T.Ogrnaophosphates and torsade de pointes ven-trieular taccardia〔J〕.Roy Soc Med, 1983, 765:983-984.
[5]Astier C, Rock E, Gueux E, et al.Functional alterations in sarco-plas-micreticulummembranes of magnesium-deficient rat skel-etalas consequences of free radical mediated process〔J〕.FreeRadic Biol Med, 1996, 20 (5) :667-674.
[6]Hans CP, Chaudhary DP, Bansal DD.Magnesium deficiency in-creases oxidative stress in rats〔J〕.Indian Exp Biol, 2002, 40 (11) :1275-1279.
[7]Hartog GJ, Haenen GR, Vegt E, et al.Supemxide dismutase:thebalance between prevention and induction of oxidative damage〔J〕.Chem Biol Interact, 2003, 145 (1) :33-39.
代谢性酸中毒 篇2
1材料与方法
1.1材料与试剂
MPPP由本室制备(醇提法提取、大孔树脂纯化[7],花色苷色素总量约92%[1]);氟化钠(分析纯):购自国药集团;TC、TG、LDL-c和HDL-c测试盒:购自温州维 日康生物 科技有限 公司 ;RNAiso Plus、 Prime ScriptTMRT reagent Kit with g DNA Eraser和SYBRPremix Ex TaqTMII试剂盒:购自大连宝生物工程有限公司。
1.2仪器与设备
T3型PCR仪,德国Biometra公司;7300型real-time PCR仪,美国ABI公司;日立7170A型全自动生化分析仪,日本日立公司;2000C型Nano Drop分光光度计,美国Thermo公司。
1.3动物及饲养
4周龄雌性断乳SD大鼠40只,体重50~80 g, 由中国医科大学实验动物中心提供,许可证号: SCXK(辽)2003-0009。饲养条件:室温(20±2)℃,相对湿度55%~65%,自然采光。每笼2只大鼠,自由饮水及摄食。动物饲料按实验分组需要,添加不同含量的MPPP,由沈阳市前民饲料厂制备。
1.4动物分组与处理
大鼠适应性喂养1周后,按照体重均衡的原则随机分为四组:对照组、氟中毒组、低剂量色素干预组和高剂量色素干预组。对照组饮用自来水(F-浓度为0.4536 mg/L),饲以普通饲料;氟中毒组、低剂量色素干预组和高剂量色素干预组均饮用含氟化钠的自来水 (F-浓度为100 mg/L),同时分别饲以MPPP含量为0、5和10 g/kg的动物饲料。实验周期共12周。实验结束后,2%戊巴比妥钠腹腔麻醉,腹主动脉采血,3 500 r/min离心,10 min后取上清备用;迅速摘取大鼠肝脏,液氮冷冻后 -80℃冻存。
1.5指标及检测
1.5.1氟含量测定血清用等体积的总离子强度调节缓冲溶液稀释后,采用氟离子选择电极法测定氟含量;肝组织氟含量测定采用酶标仪 - 氟试剂分光光度法[8],取肝组织0.05 g,脂肪酶和蛋白酶消化后, 随即加入硝酸银 - 硝酸混合溶液,并迅速盖上已用饱和Na OH溶液涂成碱膜的干燥盖子,55℃恒温箱中扩散24 h,加入显色剂150μl,用酶标仪于630 nm波长处测定肝组织中的氟含量。
1.5.2血脂测定血清总胆固醇 (total cholesterol, TC)、总甘油三酯(triglycerides,TG)、低密度脂蛋白胆固醇 (low density lipoprotein cholesterol,LDL-c) 和高密度脂蛋白胆固醇 (high density lipoprotein cholesterol,HDL-c)采用试剂盒方法,按照说明书要求用全自动生化分析仪测定。血清TC、TG采用氧化酶法,HDL-c、LDL-c采用直接法进行检测。
1.5.3肝脏胆固醇代谢基因m RNA的表达1总RNA的提取:采用RNAiso Plus提取肝组织总RNA,操作按RNAiso说明书进行,用Nano Drop分光光度计检测总RNA提取液,分别计算各样品的纯度和浓度。2逆转录反应:按照Prime Script逆转录说明书,在PCR仪上进行c DNA合成,反应参数为: 37℃ 15 min,85℃ 5 s,4℃保存。3引物合成:从Genebank中查找大鼠3- 羟基 -3- 甲基戊二酸单酰辅酶A还原(3-hydroxy-3-methyl glutaryl coenzyme A reductase,HMG-Co AR)、 胆固醇7α- 羟化酶 (cholesterol 7-alpha hydroxylase,CYP7αl)、低密度脂蛋白受体(low density lipoprotein receptor,LDLr) 和内参 β-actin的基因序列,引物由宝生物(大连) 工程有限公司设计并合成。引物序列及产物大小, 见表1。4荧光定量PCR反应:应用SYBRPremix Ex TaqTMII试剂盒进行实时定量PCR,20μl的PCR反应体系按说明书配置。实时定量PCR扩增标准程序:95℃预变性30 s;PCR反应95℃变性5 s, 60℃退火31 s,共40个循环。PCR数据分析采用2-△△CT法。
1.6统计学分析
所有数据采用SPSS 13.0统计软件进行分析。 计量数据采用均数±标准差(±s)表示。组间比较采用方差分析,检验水准为 α=0.05。
2结果
2.1氟中毒模型的建立
实验结束时,对照组大鼠血氟和肝氟含量均明显低于其他各组(P <0.01),提示氟中毒大鼠模型建立成功(表2)。
(n =3,±s)
注:覮,P <0.01
2.2血脂结果
由表3可见,与对照组比较,氟中毒组血清TC含量明显增高(P <0.05),LDL-c增加了17%;而与氟中毒组相比,低、高剂量色素干预组血清TC含量分别降低了10%和4%,LDL-c分别降低了16%和4%。
(n =10,mmol/L,±s)
注:覮,P <0.05
2.3胆固醇代谢基因mRNA的表达
表4中,低、高剂量色素干预组大鼠肝脏CYP7α1和LDLr m RNA表达水平均高于氟中毒组,且只有高剂量色素干预组有统计学意义 (P < 0.05)。各指标溶解曲线和扩增曲线见附图。
(n =10,±s)
注:覮,P <0.05
A:CYP7α1;B:HMG-CoAR;C:LDLr;D:β-actin;E:扩增曲线
3讨论
慢性氟中毒是一种全身性疾病,除引起氟斑牙和氟骨症外,对多种软组织和器官均有不同程度的损伤。肝脏是机体参与解毒和脂质代谢的重要器官,氟中毒可引起肝脏功能异常,同时伴有脂代谢障碍[5]。本研究与VASANT[9]结果一致,过量氟摄入诱发大鼠高胆固醇血症。高胆固醇血症是动脉粥样硬化和冠心病发生发展的重要危险因素,而降低血中TC水平可显著减少心血管病的发生[10,11]。笔者发现, 在MPPP的干预下氟中毒大鼠血清TC和LDL-c含量均呈现不同程度的下降,这就提示MPPP参与了机体胆固醇的代谢过程。
肝脏作为人体胆固醇合成、摄取、转化的主要场所,主要从两个方面调节胆固醇代谢:1在酶的作用下完成内源性胆固醇的生物合成;2催化胆固醇分解为胆汁酸并排出体外。HMG-Co AR作为内源性胆固醇合成的限速酶[12],其表达水平直接关系到体内胆固醇合成的数量。本次实验结果显示,MPPP对氟中毒大鼠肝脏HMG-Co AR m RNA的表达无明显作用。同样,国外学者用富含花色苷的泰国黑米提取物培养Hep G2细胞,HMG-Co AR m RNA的表达也未发生改变[13]。这就提示,花色苷并不影响胆固醇的内源性合成,而促进胆固醇的分解代谢可能是其降胆固醇的主要途径。
事实上,血液中70%的胆固醇由LDL和极低密度脂蛋白携带,其中90%的LDL是通过和肝细胞膜上丰富的LDLr结合,完成胆固醇的细胞内吞噬作用[14]。而肝脏中的胆固醇必须在限速酶CYP7α1参与下,方可转化为胆汁酸[15]。因此,LDLr和CYP7α1在维持胆固醇稳态及胆汁酸合成中发挥着重要作用。笔者发现,MPPP可同时上调氟中毒大鼠肝脏LDLr和CYP7α1 m RNA表达,这更有利于促进胆固醇在肝细胞内的转化。此结果在细胞实验中也得到了证实[4,13],值得一提的是,WANG[4]用矢车菊 -3葡萄糖苷处理小鼠原代肝细胞时,发现CYP7α1表达的增加,并与肝X受体 α 呈依赖性,认为花色苷促进CYP7α1表达是通过其上游调控因子肝X受体 α 实现的。至于MPPP的上调作用是否与肝X受体 α 有关,尚需进一步证实。
